探索超低溫冷凍對(duì)綿羊卵母細(xì)胞四跨膜蛋白CD9的
時(shí)間:2019-08-06 10:06來(lái)源: 作者:ydgmve2020yyx 點(diǎn)擊:
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1.卵母細(xì)胞的采集和體外成熟培養(yǎng)(IVM) MVE液氮罐 從屠宰場(chǎng)收集的新鮮綿羊卵巢,，放在滅菌過(guò)并預(yù)熱的37℃、0.9%生理鹽水保溫杯中,，送到實(shí)驗(yàn)室。再用同樣生理鹽水清洗卵巢2～3遍,，直至干
1.卵母細(xì)胞的采集和體外成熟培養(yǎng)(IVM) MVE液氮罐
從屠宰場(chǎng)收集的新鮮綿羊卵巢,，放在滅菌過(guò)并預(yù)熱的37℃、0.9%生理鹽水保溫杯中,，送到實(shí)驗(yàn)室,。再用同樣生理鹽水清洗卵巢2～3遍，直至干凈,。使用抽吸法吸取卵泡液,，顯微鏡下篩取顆粒細(xì)胞緊密的卵丘卵母細(xì)胞復(fù)合體(COCs)，放入預(yù)先加熱的采卵液和成熟液各洗3次,，放入成熟微滴中,，CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)23～24h。培養(yǎng)時(shí)間結(jié)束后使用透明質(zhì)酸酶去顆粒細(xì)胞進(jìn)行10～15min的消化,。在顯微鏡下挑選形態(tài)完整,、胞質(zhì)均勻并排出第一極體的卵母細(xì)胞。
2.卵母細(xì)胞的冷凍保存
BS,、VS,、ES預(yù)先在室溫下平衡20min左右，再把處理好的細(xì)胞放入BS中稍微洗滌后就移入ES中停留5～10min,，經(jīng)過(guò)皺縮又復(fù)張到原先大小的80%為止,，再移入VS后一并吸入冷凍管中，投入液氮罐中進(jìn)行冷凍保存,。
3.解凍
將1.0mol/L蔗糖溶液37℃預(yù)熱20min,，再將1.0、0.5,、0.25mol/L蔗糖溶液和BS分別放入預(yù)熱的4孔皿中,，室溫下平衡20min。將冷凍細(xì)胞分別在上述梯度蔗糖溶液中分別放置3min,，最后轉(zhuǎn)入BS中,，緩慢升溫5min，即可進(jìn)行下一步試驗(yàn),。
4.免疫組化
用預(yù)熱的生理鹽水清洗卵巢后放入4%多聚甲醛中,，4℃固定24h，然后移入30%蔗糖溶液中脫水,，脫水至卵巢在自然狀態(tài)下下沉至底部即可,。將處理好的卵巢放入冷凍切片機(jī)里冷凍30min，用O.C.T.包埋,。切片厚度為10μM的卵巢放在防脫載玻片上放進(jìn)PBS溶液中4℃過(guò)夜,。用0.1%TritonX-100里通透30min,，用PBS在脫色搖床上搖洗3次，每次10min,。然后放入CD9一抗Anti-CD9Antibody(1：100)(陰性對(duì)照加PBS代替一抗)中4℃過(guò)夜,。經(jīng)一抗孵育的切片用PBS搖洗3次，每次10min后室溫?fù)u床孵育二抗GoAtAnti-rAbbitI9GH&L(1：200)孵育1～2h,，再用PBS搖洗3次,，每次10min。DAPI室溫孵育5min,，PBS搖洗3次,，最后滴加抗熒光淬滅劑，即可熒光顯微鏡觀察,。
5.實(shí)時(shí)熒光定量PCR
(1)綿羊卵母細(xì)胞總RNA的提取 RNA提取依據(jù)微量樣品總RNA提取試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。卵母細(xì)胞的收集同1.2.1,、1.2.2和1.2.3步驟,，各收集300個(gè)新鮮GV期、MⅡ期卵母細(xì)胞和冷凍GV期,、MⅡ期卵母細(xì)胞,，離心去上清加入350μL終濃度1%裂解液，再加5μL的4ng/μLCArrierNA工作液,，勻漿,，加入1倍體積70%乙醇，再將所有液體移入吸附柱crⅠ上放進(jìn)離心管里,，12000r/min離心1min,，棄廢液。加350μL去蛋白液,，12000r/min離心1min,，棄廢液。管中加80μL配制好得dnAsEⅠ工作液,，室溫放置15min加350μL去蛋白液,，12000r/min離心1min，棄廢液,。再加500μL漂洗液,，室溫放置2min，12000r/min離心1min,，棄廢液,。12000r/min離心2min，棄廢液,，置于室溫?cái)?shù)分鐘以徹底曬干殘余漂洗液,。將吸附柱crⅠ放入新的離心管中,，加入14μLrNAse-freeddh20，室溫放置2min,，13000r/min離心2min,，所得溶液為RNA溶液。用酶標(biāo)儀測(cè)定RNA的D260nm/D280nm值,。
(2)總RNA反轉(zhuǎn)錄合成cDNA 按照Pri-mESCriptTMrTMAsterMix(PerfectreAl-time)試劑盒說(shuō)明書(shū),，PCR反應(yīng)總體系為20μL：5×Prime-ScriptTMrTMAsterMix4μL，rNA5.5μL,，rNAse-freeddh2O10.5μL,。輕輕混勻，37℃15min,，85℃5s,，溫度降到4℃終止反應(yīng)，-80℃保存,。
(3)實(shí)時(shí)熒光定量PCR 利用SYBr PreMixExTAqTMⅡ檢測(cè)綿羊卵母細(xì)胞CD9基因的相對(duì)表達(dá)量,。引物序列見(jiàn)表1 MVE液氮罐
PCR擴(kuò)增體系20μL：SYBR(PreMixExTAqTMⅡ(2×)10μL，ROXReferenceDye(50×)0.4μL,，上,、下游引物(10μMoL/L)各0.5μL，RNAse-free ddH2O7.6μL,，cdnA1μL,。每個(gè)樣品做3個(gè)技術(shù)重復(fù)和3個(gè)平行試驗(yàn)。PCR反應(yīng)程序：95℃30s;95℃30s,，61℃30s,，72℃20s;95℃1Min，55℃30s;95℃30s,。反應(yīng)結(jié)束后根據(jù)所得ct值計(jì)算CD9mRNA的相對(duì)表達(dá)量,，采用sAs軟件中GLM進(jìn)行方差分析，并使用鄧肯氏多重比較,，P<0.05為差異顯著,。
6.Western blotting分析 卵母細(xì)胞的蛋白提取采用了細(xì)胞總蛋白提取的方法。同1,、2和3步驟收集新鮮GV期,、MⅡ期卵母細(xì)胞和冷凍GV期、MⅡ期卵母細(xì)胞各500個(gè),，10000R/Min離心2Min,，棄上清液。震蕩至細(xì)胞沉淀完全擴(kuò)散。加28μLRiPA裂解液,，用超聲波破碎儀破碎數(shù)秒后再加2μLPMSF蛋白酶抑制劑和2μLβ-巰基乙醇,，整個(gè)過(guò)程均在冰上進(jìn)行，最后加8μLSDS-PAGE蛋白上樣緩沖液(5×)充分混合后,，95℃變性5Min,。配制5%濃縮膠和12%分離膠，進(jìn)行SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳,。在20MA電流,、20MV恒壓的條件下進(jìn)行轉(zhuǎn)膜，取出PVdF膜后放入封閉液中,，室溫?fù)u床1～2h,，以便去掉膜上的非特異性蛋白，提高目的蛋白與抗體的特異性結(jié)合,。分別放入Anti-CD9Antibody(1：1000)和MsMAbtobEtAActin(1：2000)中,，4℃過(guò)夜。取出與一抗孵育的膜,，用洗膜液搖洗3次,，每次10Min。再分別與CD9二抗donKEyAnti-RAbbitiGGh&L(hRP)(1：2000)和β-Actin二抗GoAtAnti-MousEiGG(h&L)hRPconJuGAtEd(1：2000)在室溫?fù)u床孵育1～2h,，洗滌3次，每次10Min,，dAb染色,，觀察結(jié)果。MVE液氮罐
從屠宰場(chǎng)收集的新鮮綿羊卵巢,，放在滅菌過(guò)并預(yù)熱的37℃、0.9%生理鹽水保溫杯中,，送到實(shí)驗(yàn)室,。再用同樣生理鹽水清洗卵巢2～3遍，直至干凈,。使用抽吸法吸取卵泡液,，顯微鏡下篩取顆粒細(xì)胞緊密的卵丘卵母細(xì)胞復(fù)合體(COCs)，放入預(yù)先加熱的采卵液和成熟液各洗3次,，放入成熟微滴中,，CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)23～24h。培養(yǎng)時(shí)間結(jié)束后使用透明質(zhì)酸酶去顆粒細(xì)胞進(jìn)行10～15min的消化,。在顯微鏡下挑選形態(tài)完整,、胞質(zhì)均勻并排出第一極體的卵母細(xì)胞。
2.卵母細(xì)胞的冷凍保存
BS,、VS,、ES預(yù)先在室溫下平衡20min左右，再把處理好的細(xì)胞放入BS中稍微洗滌后就移入ES中停留5～10min,，經(jīng)過(guò)皺縮又復(fù)張到原先大小的80%為止,，再移入VS后一并吸入冷凍管中，投入液氮罐中進(jìn)行冷凍保存,。
3.解凍
將1.0mol/L蔗糖溶液37℃預(yù)熱20min,，再將1.0、0.5,、0.25mol/L蔗糖溶液和BS分別放入預(yù)熱的4孔皿中,，室溫下平衡20min。將冷凍細(xì)胞分別在上述梯度蔗糖溶液中分別放置3min,，最后轉(zhuǎn)入BS中,，緩慢升溫5min，即可進(jìn)行下一步試驗(yàn),。
4.免疫組化
用預(yù)熱的生理鹽水清洗卵巢后放入4%多聚甲醛中,，4℃固定24h，然后移入30%蔗糖溶液中脫水,，脫水至卵巢在自然狀態(tài)下下沉至底部即可,。將處理好的卵巢放入冷凍切片機(jī)里冷凍30min，用O.C.T.包埋,。切片厚度為10μM的卵巢放在防脫載玻片上放進(jìn)PBS溶液中4℃過(guò)夜,。用0.1%TritonX-100里通透30min,，用PBS在脫色搖床上搖洗3次，每次10min,。然后放入CD9一抗Anti-CD9Antibody(1：100)(陰性對(duì)照加PBS代替一抗)中4℃過(guò)夜,。經(jīng)一抗孵育的切片用PBS搖洗3次，每次10min后室溫?fù)u床孵育二抗GoAtAnti-rAbbitI9GH&L(1：200)孵育1～2h,，再用PBS搖洗3次,，每次10min。DAPI室溫孵育5min,，PBS搖洗3次,，最后滴加抗熒光淬滅劑，即可熒光顯微鏡觀察,。
5.實(shí)時(shí)熒光定量PCR
(1)綿羊卵母細(xì)胞總RNA的提取 RNA提取依據(jù)微量樣品總RNA提取試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。卵母細(xì)胞的收集同1.2.1,、1.2.2和1.2.3步驟,，各收集300個(gè)新鮮GV期、MⅡ期卵母細(xì)胞和冷凍GV期,、MⅡ期卵母細(xì)胞,，離心去上清加入350μL終濃度1%裂解液，再加5μL的4ng/μLCArrierNA工作液,，勻漿,，加入1倍體積70%乙醇，再將所有液體移入吸附柱crⅠ上放進(jìn)離心管里,，12000r/min離心1min,，棄廢液。加350μL去蛋白液,，12000r/min離心1min,，棄廢液。管中加80μL配制好得dnAsEⅠ工作液,，室溫放置15min加350μL去蛋白液,，12000r/min離心1min，棄廢液,。再加500μL漂洗液,，室溫放置2min，12000r/min離心1min,，棄廢液,。12000r/min離心2min，棄廢液,，置于室溫?cái)?shù)分鐘以徹底曬干殘余漂洗液,。將吸附柱crⅠ放入新的離心管中,，加入14μLrNAse-freeddh20，室溫放置2min,，13000r/min離心2min,，所得溶液為RNA溶液。用酶標(biāo)儀測(cè)定RNA的D260nm/D280nm值,。
(2)總RNA反轉(zhuǎn)錄合成cDNA 按照Pri-mESCriptTMrTMAsterMix(PerfectreAl-time)試劑盒說(shuō)明書(shū),，PCR反應(yīng)總體系為20μL：5×Prime-ScriptTMrTMAsterMix4μL，rNA5.5μL,，rNAse-freeddh2O10.5μL,。輕輕混勻，37℃15min,，85℃5s,，溫度降到4℃終止反應(yīng)，-80℃保存,。
(3)實(shí)時(shí)熒光定量PCR 利用SYBr PreMixExTAqTMⅡ檢測(cè)綿羊卵母細(xì)胞CD9基因的相對(duì)表達(dá)量,。引物序列見(jiàn)表1 MVE液氮罐
PCR擴(kuò)增體系20μL：SYBR(PreMixExTAqTMⅡ(2×)10μL，ROXReferenceDye(50×)0.4μL,，上,、下游引物(10μMoL/L)各0.5μL，RNAse-free ddH2O7.6μL,，cdnA1μL,。每個(gè)樣品做3個(gè)技術(shù)重復(fù)和3個(gè)平行試驗(yàn)。PCR反應(yīng)程序：95℃30s;95℃30s,，61℃30s,，72℃20s;95℃1Min，55℃30s;95℃30s,。反應(yīng)結(jié)束后根據(jù)所得ct值計(jì)算CD9mRNA的相對(duì)表達(dá)量,，采用sAs軟件中GLM進(jìn)行方差分析，并使用鄧肯氏多重比較,，P<0.05為差異顯著,。
6.Western blotting分析 卵母細(xì)胞的蛋白提取采用了細(xì)胞總蛋白提取的方法。同1,、2和3步驟收集新鮮GV期,、MⅡ期卵母細(xì)胞和冷凍GV期、MⅡ期卵母細(xì)胞各500個(gè),，10000R/Min離心2Min,，棄上清液。震蕩至細(xì)胞沉淀完全擴(kuò)散。加28μLRiPA裂解液,，用超聲波破碎儀破碎數(shù)秒后再加2μLPMSF蛋白酶抑制劑和2μLβ-巰基乙醇,，整個(gè)過(guò)程均在冰上進(jìn)行，最后加8μLSDS-PAGE蛋白上樣緩沖液(5×)充分混合后,，95℃變性5Min,。配制5%濃縮膠和12%分離膠，進(jìn)行SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳,。在20MA電流,、20MV恒壓的條件下進(jìn)行轉(zhuǎn)膜，取出PVdF膜后放入封閉液中,，室溫?fù)u床1～2h,，以便去掉膜上的非特異性蛋白，提高目的蛋白與抗體的特異性結(jié)合,。分別放入Anti-CD9Antibody(1：1000)和MsMAbtobEtAActin(1：2000)中,，4℃過(guò)夜。取出與一抗孵育的膜,，用洗膜液搖洗3次,，每次10Min。再分別與CD9二抗donKEyAnti-RAbbitiGGh&L(hRP)(1：2000)和β-Actin二抗GoAtAnti-MousEiGG(h&L)hRPconJuGAtEd(1：2000)在室溫?fù)u床孵育1～2h,，洗滌3次，每次10Min,，dAb染色,，觀察結(jié)果。MVE液氮罐
